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    PCR試劑盒實(shí)驗過(guò)程污染問(wèn)題探究
    點(diǎn)擊次數:160 更新時(shí)間:2024-03-29

    PCR反應的最大特點(diǎn)是具有較大擴增能力與高的靈敏性,但令人頭痛的問(wèn)題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。下面歸納PCR試劑盒實(shí)驗過(guò)程的污染與對策如下:

    一、污染原因:

    (一)標本間交叉污染:

    標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時(shí),由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過(guò)程中,由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。

    (二)PCR試劑的污染:

    主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.

    (三)PCR擴增產(chǎn)物污染:

    這是PCR反應中最主要最常見(jiàn)的污染問(wèn)題,因為PCR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml),遠遠高于PCR檢測數個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。

    還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時(shí)就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地搖動(dòng)反應管,開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個(gè)氣溶膠顆??珊?8000拷貝,因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題.

    (四)實(shí)驗室中克隆質(zhì)粒的污染:

    在分子生物學(xué)實(shí)驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對照的檢驗室,這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內含量相當高,另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內的質(zhì)粒,由于活細胞的生長(cháng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強的生命力,其污染可能性也很大。

    污染的監測:

    一個(gè)好的實(shí)驗室,要時(shí)刻注意污染的監測,考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

    二、防止污染的方法:

    (一)合理分隔實(shí)驗室:

    將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應與其它步驟嚴格分開(kāi)。最好能劃分①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環(huán)擴增區;④PCR產(chǎn)物鑒定區。其實(shí)驗用品及吸樣槍?xiě)獙?zhuān)用,實(shí)驗前應將實(shí)驗室用紫外線(xiàn)消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

    (二)吸樣槍:吸樣槍污染:

    是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個(gè)嚴重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心,吸樣要慢,吸樣時(shí)盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

    (三)預混和分裝PCR試劑:

    所有的PCR試劑都應小量分裝,如有可能,PCR反應液應預先配制好,然后小量分裝,-20℃保存。以減少重復加樣次數,避免污染機會(huì )。另外,PCR試劑,PCR反應液應與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存,不應放于同一冰盒或同一冰箱。

    (四)防止操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。

    (五)設立適當的陽(yáng)性對照和陰性對照:

    陽(yáng)性對照以能出現擴增條帶的低量的標準病原體核酸為宜,并注意交叉污染的可能性,每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

    (六)減少PCR循環(huán)次數,只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。

    (七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,以避免樣本


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