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    免疫熒光實(shí)驗過(guò)程常見(jiàn)問(wèn)題分析
    點(diǎn)擊次數:110 更新時(shí)間:2024-05-06

           免疫熒光實(shí)驗原理很簡(jiǎn)單,其實(shí)就是使用熒光二抗,并在熒光顯微鏡下采集圖像,其它的和IHC或ICC區別不大。實(shí)驗過(guò)程常見(jiàn)問(wèn)題分析:

    1、目標蛋白的熒光很弱,導致組間差異并不明顯,造成假陰性結果

    這種情況出現后,首先要檢查一下抗體對不對,是否適用于你的預處理組織。一個(gè)典型的例子就是,有些抗體只適用于冰凍切片,但若將其應用于石蠟切片,就會(huì )造成弱標記或無(wú)標記現象。

    然后通過(guò)文獻等查找一下目標蛋白在該組織或細胞的表達豐度如何。若該蛋白本身表達就很少,那就沒(méi)啥可說(shuō)的,你的結果應該沒(méi)問(wèn)題。

    此外,如果抗體修復不充分,抗原表位未全暴露,也會(huì )出現弱標記現象。比如,盡管大多數抗體都是在酸性環(huán)境中修復,但是也存在少量的抗體需要在堿性環(huán)境中修復,建議查看抗體說(shuō)明書(shū),嚴格按照其修復條件進(jìn)行實(shí)驗。

    2、目標蛋白的熒光太強,甚至形成非特異性的標記,一些背景染色可能被誤認為陽(yáng)性區域,造成假陽(yáng)性結果

    這種情況一般出現在抗體濃度過(guò)高而漂洗又不充分的時(shí)候。多余的抗體會(huì )吸附在組織上,造成熒光圖像整體高背景。

    改進(jìn)方法是適當降低一抗或者二抗的濃度,增加漂洗時(shí)間,一般能夠有所改善。

    3、DAPI染細胞核時(shí),加入的試劑太多,造成高背景染色

    現在都是使用的防熒光衰減DAPI試劑,使用時(shí)滴上一滴就能將細胞核標記。

    但是這也帶來(lái)一個(gè)小問(wèn)題。滴加的量太多時(shí),會(huì )造成整張圖像呈現出藍色的背景。采集得到的圖像會(huì )很不好看,如果單純使用γ值曲線(xiàn)去調整,圖像中的細胞核會(huì )呈現出假假的感覺(jué),像是P上去的。

    因此,滴加的DAPI不要太多,只需覆蓋上薄薄的一層即可。事實(shí)上,個(gè)人認為只要切片沒(méi)有暴露在自然光或者激發(fā)光之下,熒光的自然衰減并沒(méi)有想象中那么快。

    4、組織切片預處理不當或采用石蠟切片,導致高背景染色

    如果組織切片,尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節不徹di,也會(huì )造成區域性的非特異性標記。建議脫蠟一定要徹di,脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。

    實(shí)驗過(guò)程中,玻片干燥了,同樣會(huì )造成高背景或大面積的非特異性標記。漂洗環(huán)節和抗體孵育環(huán)節最容易出現干片現象,尤其是大批量實(shí)驗時(shí),一定要注意。使用免疫組化專(zhuān)用筆畫(huà)個(gè)圈,可以有效改善。

    5、采集圖像過(guò)程不當,導致原始圖像不佳,直接影響后續半定量分析

    采集圖像時(shí)不要對每一張圖像都加上標尺,否則后期采用Image J或者IPP進(jìn)行分析時(shí),這些標尺會(huì )對結果造成影響。

    采集圖像時(shí),速度要快。如果激發(fā)光很長(cháng)時(shí)間對準目標區域,此區域內的熒光衰減會(huì )極快,有經(jīng)驗的人都知道,不必多說(shuō)。因此,目標區域較小時(shí),一定要盡量快速采集,減少人為實(shí)驗誤差。

    采集圖像時(shí),必須固定一個(gè)γ值,不可以在采集過(guò)程中修改。因為,γ值確實(shí)可以改善圖像的某些瑕疵,但是這樣一來(lái),圖像的熒光分布和強度會(huì )受到γ值的極大影響。調整幅度太大,更會(huì )造成熒光假假的感覺(jué),非常失真。

    當然了,后期半定量分析時(shí),如果一定要調整γ值,那也是對整批次圖像的統一調整,而不是某幾張圖像。千萬(wàn)別走入造假的險境之中。


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