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    普通pcr和熒光定量pcr引物設計比較
    點(diǎn)擊次數:90 更新時(shí)間:2024-05-17

    普通pcr和熒光定量pcr引物設計比較:

    一、方法不同

    1、普通pcr引物設計:引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。

    2、熒光定量pcr引物設計:通過(guò)熒光染料或熒光標記的特異性探針,標記跟蹤PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監測反應,利用與之相適應的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析,計算待測樣品模板的初始濃度 


    二、原理不同 

    1、普通pcr引物設計:為了找到一對合適的核苷酸片段,使其能有效地擴增模板DNA序列。

    2、熒光定量pcr引物設計:在PCR反應體系中加入熒光基團,通過(guò)熒光信號不斷累積而實(shí)現實(shí)時(shí)監測PCR全程,然后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中,對全程PCR擴增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測,根據反應時(shí)間和熒光信號的變化可以繪制成一條曲線(xiàn)。

     

    三、注意事項不同

    1、普通pcr引物設計:引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級結構。引物長(cháng)度在15~30堿基之間。

    1、熒光定量pcr引物設計:實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀應安放在濕度較低、灰塵較少、遠離水池的平穩臺面上,不能有強光直射,室內應通風(fēng)良好,無(wú)腐蝕性氣體 。

    假陽(yáng)性是指出現的 PCR 擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。

    產(chǎn)生的原因有:

    ①引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進(jìn)行 PCR 擴增時(shí),擴增出的 PCR 產(chǎn)物為非目的序列;

    ②靶序列太短或引物太短;

    ③靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染。

    解決方法有:操作輕柔,防止靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外造成污染;除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材高壓消毒;離心管及加樣槍頭等一次性使用。必要時(shí),可在加標本前,將反應管和試劑用紫外光照射,以破壞存在的核酸。


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