• 公司公告

    更多公告>>
    技術(shù)文章
    當前位置:首頁(yè) > 技術(shù)文章 > PCR反應條件把控
    PCR反應條件把控
    點(diǎn)擊次數:57 更新時(shí)間:2024-06-03

             PCR 反應體系由反應緩沖液(10×PCR Buffer)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、

    耐熱 DNA 聚合酶(Taq 酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2)、靶序列(DNA 模板)

    五部分組成。各個(gè)組份都能影響 PCR 結果的好壞。PCR反應需要一定的條件才能完成,這些條件主要有以下方面:

    一、緩沖液

    任何一個(gè)生化反應都必須在一定的緩沖體系中進(jìn)行,緩沖體系除了提供一定的pH緩沖能力外,還有一些有助于反應進(jìn)行的成分。PCR反應緩沖液通常采用10 mmol/L Tris-HClpH 8.3-9.0,室溫)緩沖液體系,其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二價(jià)陽(yáng)離子,一般采用Mg2+,以MgCl2的形式提供,Mg2+的濃度高低可顯著(zhù)影響 PCR擴增產(chǎn)物的特異性,此外,緩沖液中還含有50 mmol/LK+,有利于引物與模板的退火。有些緩沖液中還加入明膠或血清白蛋白(100 μg/mL)及去污劑(如Twcen20 等),對Taq DNA聚合酶起穩定作用。

    二、模板

    PCR模板是含有待擴增序列的 DNA、mRNAcDNA等,模板數量可直接影響擴增的效果。對于一般的 PCR擴增,104107個(gè)模板分子可達到滿(mǎn)意的效果,一般宜用納克(ng)級的克隆DNA、微克(μg)水平的染色體DNA102105拷貝待擴增的DNA片段作為起始材料。除了數量外,模板的質(zhì)量也非常重要,不能有太多的蛋白質(zhì)和其他污染,特別是其他DNA的污染,即使是痕量的DNA,也會(huì )導致非特異性產(chǎn)物。

    三、dNTP

    dNTPdATP、dTTP、dGTP、dCTP的總稱(chēng)。貯備液為pH 7.0 左右,其濃度一般為20 mmol,-20℃保存。體系中為20~200 μmol即可,過(guò)低則反應速度下降,濃度過(guò)高則特異性下降,因為dNTP能絡(luò )合溶液中的Mg2+,產(chǎn)生錯配或抑制Taq DNA聚合酶活性。

    四、耐熱的DNA聚合酶

    PCR反應中使用的 DNA聚合酶必須耐高溫,在90℃以上的高溫下仍能有活性,正是由于耐熱DNA聚合酶的應用才使 PCR技術(shù)得以實(shí)現,目前使用的耐高溫DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。

    五、引物

    PCR反應的最佳條件

    根據大量的研究報道,PCR反應的最佳條件為:①Taq DNA聚合酶的濃度為1.0-2.5 U/100μL反應液;②dNTP的濃度為20200 μmol/L;③Mg2+濃度為0.52.5 mmol/L;④引物的濃度為0.21.0 μmol/L。在準備具體的PCR反應時(shí),還要針對模板特性、PCR儀等進(jìn)行上述反應體系的優(yōu)化,并設置試驗確定連退火溫度、延伸時(shí)間,建立其相應的PCR反應優(yōu)程序。


    聯(lián)系人:王經(jīng)理
    點(diǎn)擊這里給我發(fā)消息
    電話(huà):
    86-021-57763112
    手機:
    18917018169

    智慧城市網(wǎng)

    推薦收藏該企業(yè)網(wǎng)站
    欧美性猛交XXXX黑人猛交_国产精品日产欧美久久久_小箩莉末发育娇小性色XXXX_中国性少妇内射XXXX狠干